O que significa "resolução" neste caso? Puzzle de microscopia resolvido
Novo método de microscopia permite identificar moléculas: a questão da resolução revelou-se um quebra-cabeças difícil
Ao avaliar a qualidade de um microscópio, a questão crucial é: qual o tamanho das estruturas mais pequenas que podem ser visualizadas com ele? A que distância podem dois objectos aproximar-se um do outro até deixarem de ser vistos como dois objectos separados e se confundirem numa única mancha de imagem?
Com os microscópios de luz convencionais, isto pode ser calculado utilizando fórmulas relativamente simples. No entanto, são atualmente utilizadas técnicas de microscopia complicadas em muitos domínios em que esta questão é muito mais difícil de responder.
Uma delas é a espetroscopia de infravermelhos por microscopia de força atómica (AFM-IR), que pode ser utilizada para visualizar a distribuição de substâncias químicas. Este método pode ser utilizado para identificar e visualizar proteínas numa célula, por exemplo. No entanto, muitas vezes não é claro se este método funciona bem em que situação. A resolução do método varia e depende de uma forma complicada de muitos efeitos diferentes. A TU Viena conseguiu agora descrever estes efeitos e calcular a resolução de tais microscópios. O que anteriormente só podia ser determinado por tentativa e erro, pode agora ser previsto de forma fiável.
Microscópios de força atómica e radiação infravermelha
A técnica de microscopia AFM-IR tem sido objeto de investigação na TU Wien há vários anos. Esta técnica combina a microscopia de força atómica (AFM) com a espetroscopia de infravermelhos (IR).
A radiação infravermelha pode ser utilizada para detetar moléculas grandes, como as proteínas: Moléculas diferentes reagem a diferentes comprimentos de onda de infravermelhos. Ao medir muitos comprimentos de onda de infravermelhos diferentes, obtém-se o chamado espetro de infravermelhos - algo como a impressão digital de uma molécula. Este espetro permite-nos reconhecer a molécula com que estamos a lidar.
"Georg Ramer, do Instituto de Tecnologias Químicas e Analíticas da TU Wien. No entanto, este método de infravermelhos pode ser combinado com um microscópio de força atómica. Este método consiste em varrer a superfície da amostra com uma ponta muito fina. Se uma molécula que está atualmente a absorver radiação infravermelha se encontrar num determinado ponto, isto leva a um aquecimento localizado precisamente nesse ponto. A amostra expande-se um pouco e isso pode ser medido com o microscópio de força atómica. Assim, não só se sabe qual é a molécula, mas também onde se encontra exatamente.
A resolução exacta? Um mistério
"Muitos investigadores e empresas utilizam este método com sucesso, porque permite saber com uma resolução muito elevada onde se encontram as moléculas. Até agora, no entanto, tem sido uma espécie de segredo sujo", diz Georg Ramer. "Ninguém podia dizer quão alta é a resolução espacial da tecnologia. As respostas que podem ser encontradas na literatura - 10 nanómetros ou mesmo 100 nanómetros - raramente são bem fundamentadas, mas antes suposições." O método nem sempre funciona igualmente bem; varia de amostra para amostra.
Isto é um problema, porque se não se conhece a resolução, não se pode dizer para que aplicações o método pode ser utilizado. Pode estar a realizar experiências para as quais esta técnica não é realmente adequada.
"Analisámos mais de perto esta questão e realizámos experiências, bem como desenvolvemos modelos computacionais e simulações em computador", diz Yide Zhang, um dos dois estudantes de doutoramento que trabalham no projeto. "Agora podemos finalmente explicar exatamente porque ocorre este estranho efeito, em que a resolução é por vezes melhor e por vezes pior".
Quando uma molécula na amostra absorve a luz infravermelha e aquece, isso nem sempre leva à mesma expansão medida. Esta expansão depende também da rapidez com que o calor é dissipado e da quantidade de material existente entre a molécula e a ponta do instrumento. O novo modelo informático pode ser utilizado para calcular a intensidade com que cada amostra reage a este efeito de calor e em que casos específicos este efeito deve ser visível e em que casos não deve.
Aprender mais sobre a amostra do que nunca
"Os nossos resultados podem agora ser utilizados para decidir antecipadamente se uma determinada experiência com o método faz sentido", afirma Georg Ramer. "E não é tudo: o nosso trabalho também nos permite interpretar as experiências de forma mais correta e otimizar a sensibilidade e a resolução." Até agora, por exemplo, a amostra era geralmente considerada como uma superfície bidimensional. Com as novas descobertas, no entanto, agora também é possível fazer afirmações sobre a terceira dimensão: É agora possível criar uma imagem 3D da amostra à escala nanométrica.
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Publicação original
Yide Zhang, Ufuk Yilmaz, Gustavo Vinicius Bassi Lukasievicz, Liam O’Faolain, Bernhard Lendl, Georg Ramer; "An analytical model of label-free nanoscale chemical imaging reveals avenues toward improved spatial resolution and sensitivity"; Proceedings of the National Academy of Sciences, Volume 122, 2025-1-24
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